栏目导航
avigation
高效液相色谱柱的使用过程中有哪些注意事项?
浏览： 71|
更新时间：2026-02-02
|
高效液相色谱（HPLC）柱是分析系统的核心，其使用寿命、分离效果与正确使用、维护和储存直接相关。下面按使用前→使用中→使用后→储存与故障预防的顺序，整理一套完整、实用的注意事项，覆盖日常操作最关键的要点。
一、使用前注意事项（决定柱寿命与基线）
新柱活化与平衡
新色谱柱出厂时保存在特定保存溶剂中（如C18常用乙腈/甲醇），使用前必须用过渡溶剂冲洗，避免保存溶剂与流动相不混溶导致沉淀、压力骤升。
反相柱：先用甲醇或乙腈低流速（0.2~0.5mL/min）冲洗10~20倍柱体积，再切换至流动相平衡。
正相柱/亲水作用柱（HILIC）：按对应溶剂体系逐步过渡，严禁直接切换极性差异大的溶剂。
流动相与溶剂要求
流动相必须经0.22μm或0.45μm滤膜过滤（水系/有机系匹配），并超声脱气或在线脱气，防止颗粒堵塞筛板、气泡导致压力波动与基线噪声。
严格控制流动相pH：
常规硅胶基质柱：pH一般2.0~8.0（不同品牌略有差异，以说明书为准）；
超出范围会导致硅胶溶解、键合相流失，柱效快速下降。
缓冲盐浓度不宜过高（一般≤50mmol/L），避免盐析堵塞色谱柱。
样品前处理要求
样品必须经0.22μm滤膜过滤或离心澄清，去除颗粒，防止柱头筛板堵塞。
样品溶剂尽量与流动相起始比例一致，避免溶剂效应导致峰形变差、分裂。
含盐、蛋白、色素的复杂基质样品（生物液、食品、环境样）必须经固相萃取（SPE）或沉淀净化，避免基质污染柱头。
系统与柱连接
安装前检查管路、进样阀、过滤器是否洁净，无残留盐、杂质。
色谱柱箭头方向与流动相流向一致，严禁反接（除非厂家明确允许反向冲洗再生）。
接头拧紧适度，避免死体积过大导致峰展宽，也不能过紧损坏螺纹。
二、使用中注意事项（保证分离与安全）
流速与压力控制
严格遵循色谱柱最大耐受压力（一般20~40MPa，看柱标签），流速逐步提升，禁止瞬间高流速冲击。
压力异常升高时立即停泵，排查：样品污染、筛板堵塞、管路堵塞、盐析、气泡。
柱温控制
使用柱温箱控温，温度波动会导致保留时间漂移、峰形异常。
一般柱温≤60℃，高温会加速键合相水解、硅胶溶解，尤其在pH极端条件下。
避免温度骤升骤降。
进样量与样品负荷
进样量不可超过柱容量，过载会导致峰拖尾、分叉、分离度下降。
微量分析柱（如2.1mm内径）进样量通常≤10μL，常规4.6mm柱≤20~50μL（依样品浓度调整）。
避免强保留物质累积
每分析一定数量的脏基质样品后，必须进行阶段性冲洗，去除强保留杂质，防止柱头污染、压力升高、峰形变差。
缓冲盐体系的关键操作
流动相含缓冲盐时，严禁直接用纯有机溶剂冲柱，会导致盐析堵塞，甚至报废色谱柱。
正确顺序：先用高比例水（90%以上水相）冲洗10~20倍柱体积→再切换至有机相冲洗。
三、使用后冲洗与维护（延长柱寿命最重要环节）
含缓冲盐流动相的冲洗步骤（最关键）
先用高纯水相（如90%水+10%乙腈/甲醇）冲洗≥20倍柱体积，彻底冲净缓冲盐；
再用高比例有机相（如90%~100%乙腈或甲醇）冲洗≥20倍柱体积，去除强保留杂质；
最后保存在厂家推荐溶剂中（反相柱常用纯乙腈或甲醇）。
不含缓冲盐流动相的冲洗
直接用强洗脱溶剂（如甲醇、乙腈）冲洗20~30倍柱体积即可。
柱头污染的处理
出现压力升高、峰拖尾、分叉、鬼峰增多，多为柱头筛板/填料污染。
可尝试：
反向低流速冲洗（部分品牌允许）；
更换入口筛板（专业操作）；
用强溶剂（如异丙醇、二氯甲烷，按柱兼容性）梯度冲洗。
四、色谱柱储存注意事项
必须保存在合适的保存溶剂中，严禁在水、缓冲盐、酸性/碱性溶液中长期存放。
两端堵头拧紧，防止溶剂挥发、填料干裂、颗粒进入。
储存环境：室温、避光、防尘，避免高温/低温极端环境。
长期不用（超过1~2周），应重新冲洗并更换新鲜保存溶剂。
五、禁忌与常见错误（一定要避免）
严禁超pH、超压、超温运行。
严禁含缓冲盐流动相直接切换纯有机溶剂（盐析致命）。
严禁未过滤样品直接进样（柱头堵塞最常见原因）。
严禁反相柱用强极性非相容溶剂（如正己烷）长期冲洗。
严禁剧烈震动、跌落、接头强行拧紧。
不同类型色谱柱（反相/正相/HILIC/离子交换）不可随意混用流动相体系。
六、快速判断色谱柱异常的信号
柱压持续升高→柱头堵塞或盐析
保留时间持续漂移→柱未平衡或键合相流失
峰拖尾、分叉、变宽→柱头污染、柱效下降
鬼峰增多→柱内杂质残留或流动相污染
压力波动→气泡或管路泄漏