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高效液相色谱柱的冲洗步骤有哪些
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更新时间：2026-10-07
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冲洗前准备，确认色谱柱的固定相类型、耐受pH范围以及保存溶剂，反相柱与正相柱冲洗溶剂存在差异，避免选用不匹配溶剂损伤填料。准备色谱级溶剂，提前超声脱气，检查管路、过滤器无堵塞。记录柱压基线，作为冲洗前后的对比参考。停止样品进样，先将流动相中含有的缓冲盐置换，盐类残留结晶会划伤填料，造成柱效快速下降。
置换缓冲盐，若流动相含有磷酸盐、醋酸盐等缓冲盐，不能直接切换高比例有机相。使用低有机相比例的水溶液，一般纯水或者5%至10%甲醇水溶液，以较低流速冲洗色谱柱，冲洗体积不少于10倍柱体积，直到管路和柱子内的缓冲盐全部被冲出，压力稳定，完成盐相置换。禁止缓冲盐直接接触高浓度有机相，防止盐析出堵塞色谱柱。
冲洗残留样品，盐冲洗完成后，逐步提升有机相比例，按照梯度方式升高有机相浓度，冲洗柱子内吸附的强保留样品组分。反相色谱柱常用甲醇或者乙腈，持续冲洗10至20倍柱体积，观察基线，待基线平稳、无杂峰、压力稳定，代表样品残留基本冲洗干净。对于强吸附、高保留样品，可适当延长冲洗时间，不可骤然大幅度改变流动相比例。
转换保存溶剂，冲洗干净样品之后，将流动相切换为色谱柱规定的保存溶剂。C18这类反相柱通常使用80%甲醇或者乙腈水溶液；正相柱一般用正己烷或者异丙醇；亲水色谱柱按照说明书要求选用保存液。以正常流速冲洗5至10倍柱体积，保证柱内溶剂替换为保存溶剂。
停泵与拆卸，溶剂置换完成，维持稳定柱压一段时间，确认基线无异常，缓慢降低流速，最后关闭泵电源。等待管路压力回落至常压，拆卸色谱柱，两端立刻拧紧柱堵头，防止填料风干，避免空气进入柱体。
冲洗后检查与记录，查看冲洗后的系统压力，对比初始压力，如果压力明显升高，说明存在残留污染，需要再次冲洗。记录冲洗时间、使用溶剂、柱压情况，做好色谱柱使用台账。
不同色谱柱注意要点，正相色谱柱不能用水相溶剂长时间冲洗，防止固定相水解损坏；离子交换柱冲洗需要严格控制pH，逐步过渡溶剂；手性色谱柱溶剂切换速度要更平缓，避免破坏手性固定相。
通用操作禁忌，冲洗流速不可超过色谱柱最大允许流速，防止高压冲击造成填料塌陷。严禁使用超出pH耐受范围的溶剂冲洗。冲洗过程避免压力剧烈波动。如果柱子长期未使用，启用前也需要按照上述流程缓慢平衡。
日常维护提示，每次测试结束都需要执行冲洗流程，样品基质复杂时，适当增加冲洗体积。冲洗溶剂必须使用色谱纯，减少杂质在柱内累积。
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